Oswaldo Gonçalves Cruz sinh ngày 5 tháng 8 năm 1872 tại São Luis do Paraitinga, một thành phố nhỏ ở bang São Paulo, là con của bác sĩ Bento Gonçalvez Cruz và Amália Bulhões Cruz. Khi còn là một đứa trẻ, ông chuyển tới Rio de Janeiro cùng với gia đình. Năm 15 tuổi, ông bắt đầu học tại Khoa Y của Rio de Janeiro và vào năm 1892 ông tốt nghiệp bác sĩ với luận văn về nước như một phương tiện phát tán vi khuẩn. Được truyền cảm hứng bởi công việc của Louis Pasteur, người đã phát triển thuyết phôi của bệnh, 4 năm sau ông đến Paris để theo học ngành vi khuẩn học tại viện Viện Pasteur, nơi tập trung những tên tuổi lớn nhất của môn khoa học này lúc bấy giờ. Ông được tài trợ bởi cha vợ là một thương nhân Bồ Đào Nha giàu có.